PCR
Keywords: PCR, DNA, Genética
thumb|200px|Máquina de PCR Polymerase Chain Reaction (PCR) é um método de amplificação (de criação de múltiplas cópias) de DNA (ácido desoxirribonucleico) sem o uso de um organismo vivo, por exemplo, E. coli ou leveduras.
| Conteúdo |
História
O processo de PCR foi inventado por Kary Mullis no início da década de 1980, tendo-lhe sido posteriormente atribuído o Prémio Nobel da Química pelo seu trabalho. Em 1989, a Hoffman La Roche & Parkin-Elmer Corporation patenteou este processo. O método PCR é usado habitualmente nos laboratórios de investigação médica e biológica para uma variedade de tarefas, como a detecção de doenças hereditárias, a identificação de "impressões digitais" genéticas, a construção de árvores filogenéticas (árvores de relação entre espécies), a clonagem de genes (ver adiante), e testes de paternidade.
Método
O método PCR pode ter início com uma quantidade muito pequena de DNA original- às vezes, uma cadeia é suficiente. Durante o processo PCR, o DNA original é copiado por uma enzima, chamada DNA-polimerase que duplica a cadeia de DNA. Geralmente, só uma pequena parte da cadeia de DNA é copiada usando PCR. Esta parte é seleccionada por iniciadores, curtas cadeias artificiais de DNA (20-40 pares de bases), que se combinam exactamente com cada região terminal da parte a ser copiada.
A máquina de PCR é basicamente um forno controlado por computador, onde um programa controla o tempo e a temperatura. O processo de PCR consiste em várias iterações , geralmente 15-30, e cada iteração é composta pelos passos seguintes (Figura 1):
1. Desnaturação (96º C, 30-600 segundos). Durante a desnaturação, o ADN de cadeia dupla é dividido em duas cadeias simples, da mesma forma que se abre um "fecho-éclair". Actualmente (Abril de 2001), a DNA-polimerase utilizada é estável a altas temperaturas. A DNA-polimerase utilizada deriva de uma bactéria que vive em Geysers e a enzima não é inactivada pela desnaturação.
2. Annealing ("emparelhamento") (65-80º C, 30-120 segundos). Durante o emparelhamento, os iniciadores ligam-se ao DNA de cadeia simples e a DNA-polimerase liga-se aos iniciadores emparelhados.
3. Alongamento (65-80º C, 30-120 segundos). Durante o alongamento, a DNA-polimerase cria a cadeia de ADN complementar à medida que percorre o ADN de cadeia simples.
Após cada iteração, a quantidade de DNA duplica. Assim, após múltiplas iterações, a quantidade de DNA aumenta é prevista por uma exponencial de base 2. Por exemplo, após 30 iterações, uma cadeia de ADN é copiada em 230 = 1 073 741 824 cadeias, que são cópias exactas da parte da primeira cadeia que foi seleccionada pelos iniciadores.
center
Aplicações
Com a técnica PCR tornou-se possível clonar genes, apenas um gene ou mesmo somente parte de um gene. Este processo não deverá ser confundido com a clonagem de um todo organismo. A clonagem de um gene envolve, em primeiro lugar, a separação de um gene de um organismo, e posteriormente a sua inserção num outro organismo, como uma bactéria. Como resultado, o gene clonado pode assim ser estudado em detalhe no novo organismo. Usa-se muitas vezes PCR neste processo para isolar um gene em particular através de amplificação, antes de este ser transferido para o novo organismo. Usa-se também PCR para introduzir mutações (alterações) nas cadeias de DNA. Através de uma mutação PCR, o gene pode então ser mutado para se estudar o efeito dessa alteração. PCR é também uma ferramenta útil em biotecnologia- por exemplo, para alterar bactérias para produzir medicamentos.
Bibliografia
Saiki, R. K., D. H. Gelfand, S. Stoffel, S. J. Scharf, R. Higuchi, G. T. Horn, K. B. Mullis, and H.
A. Erlich. "Primer-Directed Enzymatic Amplification of DNA with a Thermostable DNA Polymerase." Science 239 (1988): 487-491.
Saiki, R. K., D. H. Gelfand, S. Stoffel, S. J. Scharf, R. Higuchi, G. T. Horn, K. B. Mullis, and H. A. Erlich. "Primer-Directed Enzymatic Amplification of DNA with a Thermostable DNA Polymerase." Science 239 (1988): 487-491.
United States Patent 5,656,493 Mullis, et al. August 12, 1997: System for automated performance of the polymerase chain reaction
United States Patent 5,656,493 Mullis, et al. August 12, 1997: System for automated performance of the polymerase chain reaction
Links externos
Filme didático, sobre todo o protocolo desta técnica de biologia molecular
Veja também
Imagens relacionadas
- Imagem:Pcr clone.png
- Imagem:Pcr gel.png
- Imagem:Pcr fingerprint.png
Créditos
- Autor original: Magnus Manske
- Tradução: José Gustavo Martins e Ana Beleza
- www.nupedia.com/article/669/